实现多重检测 我国推动实时荧光PCR技术再上新台阶

　　近期，厦门大学研究团队成功研发出一种荧光PCR新技术，将荧光PCR的单管检测能力提高了至少一个数量级，推动了主流荧光PCR仪器检测技术的发展。研究成果发表在《美国国家科学院院刊》(PNAS)杂志上。
 

　　作为目前最为成熟、临床应用最广泛的分子诊断技术，PCR(聚合酶链式反应)技术具有灵敏度高、特异性好、及时方便等优点，在传染性疾病检测、肿瘤个体化诊疗、遗传性疾病筛查、血液筛查等领域有着巨大的应用价值，已经成为许多临床诊断的“金标准”。在疫情期间，PCR技术在病毒核酸检测中发挥了重要作用，其发展也更受重视。
 

　　PCR技术发展至今已经衍生出多重PCR (multiplex PCR)、实时荧光定量PCR、数字PCR(digital PCR)等多种技术。其中第二代技术——实时荧光定量PCR是当前的主流。该技术通过特异性荧光探针实时监测扩增片段荧光信号，同时实现了绝对基因表达和相对定量检测。同时通过闭管检测的模式降低了扩增产物的污染机会，节省时间和劳动力，有利于自动化的实现。
 

　　然而实时荧光定量PCR的检测能力受限于仪器检测通道数目，单个反应能检测到的靶基因数量很难超过6个(2-4)。在PCR之后添加熔解分析步骤是研究者解决这一问题的尝试，虽然在一定程度上增加了可检测靶基因数目，但也存在检测成本升高、检测错误率增加等问题。靶基因检测数量的局限使实时荧光定量PCR技术在涉及多靶点的复杂疾病检测中难以发挥作用。
 

　　2022年2月24日，厦门大学生命科学学院研究团队在《美国国家科学院院刊》(PNAS)杂志上发表了一项研究成果，报道了一种称为“MeltArray”的单步、多重均相荧光PCR新技术。
 

　　该技术利用了荧光PCR反应中Taq DNA聚合酶的5‘-瓣状内切酶活性，将位于引物下游的“媒介探针”切割，释放出“媒介引物”，“媒介引物”结合到反应体系中的分子信标报告探针上。在Taq酶聚合活性作用下，“媒介引物”沿着分子信标延伸，生成具有特定熔点值的荧光双链。由于每个分子信标可以允许多个“媒介引物”形成一系列具有不同熔点值的荧光双链，单个MeltArray多重荧光PCR反应可检测的总靶基因数目就等于反应中分子信标数量乘以其所容纳的“媒介引物”数量。
 

　　为验证MeltArray的多重检测能力，研究者设计了多种检测体系，包括人类Y染色体微缺失的20重检测、确定大肠杆菌血清型的62重检测、同时识别和定量呼吸道病原体的24重检测、直肠癌组织样本的KRAS突变微测序分析等，对应了分子诊断的遗传病、传染病和肿瘤分子诊断三大应用领域，均有良好的灵敏度和特异性。
 

　　在高通量测序技术出现后，靶基因检测数量有限的实时荧光定量PCR通常被认为是“低端”的检测技术。MeltArray不需要改变现有的荧光PCR仪器就极大增加了单个闭管实时荧光PCR一步法能检测的最大靶基因数量，推动荧光PCR这一“老技术”再上“新台阶”，填补了长期存在于低阶PCR和高通量检测二者之间的技术空白。
 

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